Амилолитический гидролиз крахмала при затирании

12.04.2017
В ходе гидролиза крахмала протекают следующие процессы: разжижение крахмального клейстера, образование и накопление декстринов (декстринизация) и образование и накопление мальтозы (осахаривание крахмала).
Процесс разжижения оклейстеризованного крахмала и образование большого количества декстринов обусловлены действием ?-амилазы (отсюда и прежнее название декстриногенамилаза). Осахаривающая способность ?-амилазы незначительна, и под ее действием может образоваться небольшое количество глюкозы.
Осахаривание крахмала в полном смысле этого слова, т. е. образование сахаров, обусловлено действием ?-амилазы; она способна разжижать оклейстеризованный крахмал лишь в небольшой степени и вызывать весьма слабое образование декстринов. В свое время этой амилазе было присвоено название сахарогенамилазы.
Поэтому, чтобы достичь полного и быстрого разжижения крахмала, необходимо иметь в заторе ферментную систему (солод, ферментные препараты), обладающую большим содержанием ?-амилазы.
В заторе, где присутствуют обе амилазы, процесс осахаривания начинается одновременно с разжижением. Осахаривание сначала идет быстро, но затем после накопления примерно 50% осахаренных продуктов крахмала скорость процесса значительно замедляется, т. е. существовавшая линейная зависимость между количеством накопленного сахара и концентрацией ферментов нарушается и дальнейшее осахаривание протекает вне этой зависимости (рис. 20).

Ни ?-амилаза, ни ?-амилаза не в состоянии полностью гидролизовать крахмал. При одновременном действии их величина гидролиза крахмала может достигать 95%.
?-амилаза катализирует процесс образования очень небольших количеств мальтозы и декстринов сравнительно небольшой молекулярной массы, при действии ?-амилазы накапливается большое количество мальтозы и незначительное количество высокомолекулярных декстринов.
?-амилаза содержится только в растительных тканях, ?-амилаза в растительных и животных тканях. В растительных тканях ?-амилаза обычно находится вместе с ?-амилазой. В ячменном солоде содержатся обе амилазы.
Процесс осахаривания, так же как и любая химическая реакция, протекает скорее при более высокой температуре; предел температуры в данном случае определяется термостойкостью ферментов, участвующих в атом процессе.
При более высокой температуре образуется большее количество декстринов и меньшее сахаров, и наоборот. Так как оба эти процесса в своей основе зависят от каталитического действия ферментов, то естественно предположить, что ?-амилаза, от действия которой зависит образование сахаров, при повышении температуры разрушается раньше, чем ?-амилаза, с активностью которой связывается образование декстринов, ?-Амилаза солода более устойчива к повышению температуры, чем ?-амилаза. При нагревании раствора, содержащего ?-амилазу, при 70° С в течение 15 мни активность этого фермента снижается незначительно; ?-амилаза в этих условиях инактивируется полностью.
Вместе с тем ?-амилаза обладает большей чувствительностью к кислотности среды, чем ?-амилаза. Доведение величины pH среды до 3,3 даже при температуре 0° С ведет к почти полной инактивации ?-амилазы; в этих же условиях ?-амилаза в значительных размерах сохраняет свою активность.
При pH ниже 2,3 и выше 9,7 действие амилаз прекращается.
Оптимальные условия кислотности для действия ?-амилазы лежат при более низком значении pH, чем для действия ?-амилазы, и в значительной мере зависят от температуры.
Д.Н. Климовский считает, что оптимум pH для ?-амилазы лежит около 6, а для ?-амилазы— около 4,8 (рис. 21), причем эти значения pH меняются в зависимости от температуры:

Величины оптимума действия солодовых амилаза по работам отдельных авторов в достаточной степени колеблются, что, по-видимому, следует связывать со степенью чистоты препаратов, с применением которых проводились исследования, характером субстрата, его концентрацией и т. п. Большое значение в этом отношении имеют температурные условия. Книн приводит для ?-амилазы оптимум действия при pH 5 (при комнатной температуре), а для ?-амилазы — около 4,5 (тоже при комнатной температуре). Де-Клерк считает оптимумом действия ?-амилазы в заторе температуру 70° С и pH 3,8, а ?-амилазы— температуру 60—65° С и pH 5,4. Такие же величины указываются и чешскими авторами. Леберле и Шустер для оптимума действия этих ферментов приводят следующие величины: для ?-амилазы pH около 5,6 при температуре 60—65° С, а для ?-амилазы pH около 4,6 при температуре 40—50° С.

Амилаза растворима в воде или в сильно разбавленных растворах солей; она делается более растворимой под влиянием пептизирующего действия разбавленных растворов солей или протеолитических ферментов типа папаина. ?-Амилаза осаждается из растворов 25—30%-ными растворами сернокислого аммония; в разбавленных растворах этилового спирта она легко растворяется, а при повышении концентрации спирта до 60% осаждается.
Растворимость ?-амилазы почти такая же, как и ?-амилазы, но для полного осаждения ее требуется более высокая концентрация сернокислого аммония и спирта.
Разжижение. Процесс разжижения сводится, по-видимому, к разрушению крахмальных зерен до размера одной молекулы, что сопровождается уменьшением вязкости. Вязкость клейстера можно уменьшить путем энергичного размешивания его, т. е. механического разбавления набухших зерен крахмала. Принципиально разжижение при помощи ферментов имеет, по крайней мере, в начале процесса аналогичный характер, так как в этот момент нельзя обнаружить наличия ни декстринов, ни мальтозы. Дальнейшее действие ферментов, сопровождаемое сильным снижением вязкости, приводит к накоплению указанных продуктов. Получение в растворе некоторого, правда, ограниченного количества редуцирующих групп свидетельствует о дальнейшем процессе, в котором, очевидно, образуются сложные декстрины. Разжижение оклейстеризованного крахмала приписывается действию ?-амилазы.
Осахаривание. Под техническим термином "госахаривание" в пивоварении подразумевается не процесс превращения крахмала в сахар, а прекращение изменения естественной окраски йодного раствора. Низкомолекулярные декстрины также обладают этим характерным для сахаров свойством, поэтому во время осахаривания происходит накопление как сахаров, так и декстринов.
Крахмал при обработке его раствором йода в йодистом калии дает характерную синюю окраску. При ферментативном расщеплении получаются менее сложные молекулы углеводов, что сопровождается изменением окраски йодного раствора, которая через пурпурную, красную и коричневую достигает окраски, соответствующей чистому раствору йода. Образующиеся декстрины являются углеводами меньшей сложности, чем крахмал, но имеют более низкую редуцирующую способность по сравнению с мальтозой. Параллельно с декстринами образуются всевозрастающие количества мальтозы, являющейся основным сахаром при ферментативном осахаривании крахмала. При наиболее благоприятных условиях действия амилаз в среднем 85% осахаривающей активности ячменного солода принадлежит ?-амилазе и только 15% — ?-амилазе.
По характеру действия на компоненты крахмала (амилозу и амилопектин) амилолитические ферменты существенно отличаются. ?-Амилаза атакует цепи глюкозных единиц как в амилозе, так и амилолектине, начиная с нередуцирующих концов и постепенно отщепляя по две глюкозные единицы, образующие вместе молекулы мальтозы. В амилозе, не имеющей ответвлений, действие ?-амилазы продолжается до полного распада цепи. Если молекула амилозы состоит из 500 глюкозных единиц, то фермент должен будет расщепить цепь на 250 молекул мальтозы, повторить одну и ту же операцию 240 раз.
В амилопектине действие ?-амилазы начинается с нередуцирующих концов любой ветви, и при постепенном отщеплении по две глюкозные единицы прекращается у места разветвления. Если цепь, которая подвергается действию ?-амилазы, состоит из четного числа глюкозных единиц, образуется только мальтоза, если число единиц нечетное, то последние три единицы остаются нерасщепленными в виде мальтотриозы.
Таким образом, под действием только одной ?-амилазы вся амилоза и около половины амилопектина превращаются в мальтозу. Если в распаде крахмала участвовала бы только одна ?-амилаза, то процесс осахаривания испытывал бы ряд трудностей: ограниченность мест приложения фермента, которая лимитируется числом концов цепей, и трудность подхода крупной молекулы ?-амилазы к тесно расположенным ответвлениям в молекуле амилопектина. При одновременном действии ?-амилазы эти трудности устраняются и объем и скорость действия ?-амилазы повышаются.
?-Амилаз а начинает свое действие не с периферийных пунктов молекулы амилопектина, а с внутренних частей молекулы, благодаря чему увеличивается количество мест приложения ?-амилазы.
Если при действии ?-амилазы только около 0,5% связей являются в крахмале разорванными, клейстер становится прозрачным и почти полностью исчезает первоначальная вязкость. Когда разорваны (0—13% связей, исчезает изменение окраски йодного раствора и полученный продукт является декстринами различных типов: неразветвленные с большим или меньшим количеством глюкозных остатков и разветвленные.
Осахаривание крахмала при помощи ?-амилазы протекает сравнительно медленно, так как в крахмале имеется только около 3% глюкозных единиц (нередуцирующих концов цепи), расположенных на периферии молекул. Если же этот процесс начинается с действия ?-амилазы, то количество нередуцирующих концов цепи увеличивается; ?-амилаза солода легко разрывает 15% мальтозных связей в крахмале, поэтому общее действие ?-амилазы увеличивается во много раз.
Лаже без участия ?-амилазы ?-амилаза способна легко разрушить как амилозу, так и амилодекстрин, превращая их в низкомолекулярные декстрины с цепями по длине меньше 10 глюкозных единиц в количестве, достигающем 20% от мальтозы. При этом образуется некоторое количество глюкозы и мальтотриозы, так как ?-амилаза в противоположность ?-амилазе, которая разрушает глюкозные цепи в определенном порядке, действует беспорядочно путем случайного выбора, причем может наблюдаться отрыв как агрегатов, состоящих из двух остатков глюкозы, так к агрегатов, состоящих из одного или трех остатков глюкозы (рис. 22).

Длительное воздействие ?-амилазы на амилозу превращает се полностью в мальтозу, мальтотриозу с небольшим количеством глюкозы. Дальнейшее разрушение мальтотриозы до мальтозы и глюкозы при участил ?-амилазы солода возможно, но процесс этот протекает чрезвычайно медленно и большого значения в пивоварении иметь не может.
Интересно отметить, что мальтотриоза не разрушается ?-амилазой. Этот сахар является конечным продуктом комбинированного действия ?- и ?-амилаз на крахмал во время затирания. ?-Амилаза катализирует распад мальтотетраозы и других более высоких полиглюкозидов, образуя одну мальтозу, а мальтотриозу этот фермент не способен разрушать. Здесь проявляется высокая специфичность действия ?-амилазы, которая требует для своего действия, по крайней мере, четырехглюкозидный полимер (дне единицы мальтозы).
Как солодовая ?-амилаза, так и ?-амилазы другого происхождения обладают общим свойством случайных атак на почти все мальтозные связи, что в итоге ведет к накоплению продуктов распада крахмала — мальтозы, мальтотриозы и разветвленных декстринов.
Так как ?-амилаза более термостабильна, чем ?-амилаза, при применении настойного метода затирания при температуре 65,5° С около 1/3 активности ?-амилазы остается в сусле после 2 ч. ?-Амилаза в этих же условиях почти полностью разрушается. При более низкой температуре можно сохранить большую часть амилаз, но скорость превращения крахмала замедляется; например, при температуре 49° С процесс протекает в три раза медленнее, чем при 65,5° С. Кроме того, следует отмстить, что при таких низких температурах клейстеризации крахмала не происходит.
Хроматографией на бумаге в сусле находят фруктозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, трисахариди, тетра-, пента-, гекса-, гепта, окта- и нонасахариды. Соотношения между фруктозой и глюкозой разные, но обычно содержание фруктозы в 4—8 раз меньше, чем глюкозы. Гиертсен нашел в 100 мл сусла от 0,15 до 0,27 г фруктозы и от 0,74 до 1,0 г глюкозы, Мак-Фарлан — 0,12 г (на 100 мл сусла) фруктозы и 1,03 г глюкозы.
Мальтоза является основным сахаром, содержащимся и сусле, и количество ее во много раз больше сахарозы; обычно в 20 раз. Это зависит от ряда технологических факторов и применяемого сырья.
Гопкинс при применении отварочного и настойного методов затирания установил, что в сусле содержатся следующие продукты распада крахмала:
- глюкоза (некоторое количество этого сахара имелось уже в солоде);
- мальтоза — главный продукт распада;
- мальтотриоза (продукт действия ?-амилазы и частично ?-амилазы при разрушении цепей с нечетным числом глюкозных остатков);
- мальтотетраоза, мальтопетраоза и, возможно, высшие линейные декстрины — как продукты действия ?-амилазы, которые не подвергались дальнейшему действию амилаз;
- разветвленные декстрины, содержащие пять или более глюкозных остатков;
- следы изомальтозы и панозы, содержащие ?-1,6-связи;
- пентоды, сахароза, фруктоза и другие сахара, перешедшие из солода.
В табл. 52 приведены результаты исследования содержания углеводов в сусле при различных методах затирания, полученные разными авторами (результаты взяты из работы Гопкинса).

Как видно из табл. 52, при отварочном методе затирания в заторе образуется больше мальтозы и меньше мальтотриозы, чем при настойном методе.
По И.Г. Лернеру, в сусле отечественных сортов пива содержится мальтозы от 59,0 до 62,9%, сахарозы от 5,0 до 5,4% и моносахаридов (глюкозы и фруктозы) от 3,2 до 5,2%,
В результате разжижающего и осахаривающего действия амилолитических и других ферментов солода в заторе происходит дополнительное накопление экстрактивных веществ.
Максимальное количество экстракта было получено при температуре 65— 70° С, причем величины выходов экстракта при этой температуре очень близки. Дальнейшее повышение температуры оказывает отрицательное влияние на повышение экстрактивности, следовательно, повышение температуры благоприятно для активности амилаз лишь до определенного предела. На основании ряда экспериментальных работ Л.И. Опарина это явление можно объяснить тем, что амилазы при нагревании адсорбируются белками, коагулированными при высокой температуре, вследствие потери ферментами их активности.
Если температура нагревания не слишком высока и структура фермента не разрушилась, то при обработке коагулированного белка с адсорбированными на нем амилазами растворами сахара или пептона часть этих ферментов переходит из нерастворимого соединения с белками в раствор и они вновь приобретают активность.
Таким образом, такие вещества, как сахара, декстрины, некоторые некоагулируемые белковые соединения, обладают защитным действием для ферментов, так как способны при повышенной температуре удерживать белки в растворе.
Как говорилось выше, оптимум температуры для действия амилолитических ферментов, по данным разных авторов, различный, поэтому твердых указаний на оптимальную температуру осахаривания затора не имеется; наиболее вероятной температурой осахаривания заторов можно считать температуру 72—76° С. Это подтверждается приведенными ниже экспериментальными данными Кольбаха о времени осахаривания лабораторного солодового затора настойным методам:

Концентрация веществ я среде оказывает влияние на действие ферментов; густые заторы осахариваются хуже, чем менее концентрированные: например, затор концентрацией 14% осахаривается скорее, чем концентрацией 22%.

Накопление и заторе сахаров, в частности мальтозы, завысит от совместного действия ?- и ?-амилаз. Если создаются наиболее благоприятные температурные условия для действия ?-амилазы, естественно ожидать большего накопления мальтозы, чем декстринов. Наиболее благоприятной температурой для образовании мальтозы является температура в заторе 63°С. При температуре 70° С, т. е. оптимуме действия ?-амилазы, хотя превращение крахмала продолжается, но при этом образуются продукты распада, которые нс являются сахарами, поэтому йодная реакция показывает отсутствие неполных продуктов осахаривания; но, так как эти продукты являются декстринами, сбраживаемость сусла понижается. В табл. 63 показано соотношение сахаров и несахаров в сусле при длительной выдержке затора при разной температуре.

Показательными являются опыты, проведенные Кольбахом, по определению влияния температуры затирания на выход экстракта и сбраживаемость полученного сусла. Работа проведена с солодом, который по лабораторному исследованию обладал экстрактивностью 80%, а полученное сусло давало величину конечной степени сбраживания 81 % (табл. 54).

Наиболее благоприятной температурой при затирании следует считать температуру несколько выше 60° С, но меньше 65° С. Большинство авторов такой температурой считают 63° С.
Это подтверждается опытами, проведенными с осахариванием 100 г разжиженного крахмала при помощи солодовой вытяжки с соблюдением одинаковых условий, но при различной температуре. В опытах были получены следующие результаты:

В начале процесса затирания накопление мальтозы, которая является основным фактором повышения сбраживаем ости, происходит более энергично, чем в последующее время. Это подтверждается данными, приведенными в табл. 55.

Неравномерное увеличение содержания мальтозы, по-видимому, вызвано начавшейся клейстеризацией крахмала, которая способствует его превращению.
Образование мальтозы в заторе непосредственно связано с повышением сбраживаемости сусла, и, конечно, температурные закономерности здесь такие же, как и в таблицах, приведенных выше. В табл. 56 показана зависимость степени сбраживания сусла от температурного режима.

Существующая в заторе концентрация водородных ионов (рН 5,6—5,9) не является оптимальной для действия амилолитических ферментов; для совместного действия ?- и ?-амилаз требуется более низкая ее величина, поэтому зависимость, например, конечной степени сбраживания от рН хотя и имеется, но относительно небольшая. Например, при прочих равных условиях работы были получены следующие величины конечной степени сбраживания:

Как указывалось выше, оптимум действия ?-амилазы находится при pH, приближающемся к 6, а ?-амилазы — при pH 4,5—4,8; таким образом, для действия ?-амнлазы условия концентрации водородных ионов значительно отличаются от оптимальных.
Оптимум pH действия амилаз, по данным Виндиша и Кольбаха, изменяется с изменением температуры. Как видно из данных, приведенных в табл. 57, при повышении температуры он отклоняется в щелочную сторону.

Для наиболее интенсивного образования мальтозы при температуре 63° С требуется pH ниже 5,6, чего в обычных заторах не бывает, а при использовании высоко карбонатных вод, когда pH затора достигает величины 5,9—6,1, создаются очень неблагоприятные условия для накапливания мальтозы.
Наиболее благоприятным условием для образования высоких выходов экстракта требуется pH 5,1, однако и этот pH для быстрого осахаривания затора является низким; нормальное время осахаривания (в течение 15 мин) в опыте Гопкинса и Краузе достигалось при pH. 5,29.
Как указывалось выше, при сушке солода активность цитолитических ферментов резко уменьшается, однако еще некоторое количество их, особенно в светлых солод ах, сохраняется и во время затирании оказывает свое положительное действие. Особенно желательно наличие ферментов цитолитического комплекса при переработке плохо растворенных солодов.
Так как оптимальная температура действия этих ферментов лежит при температуре 45° С и при pH около 5, то действие части ферментов, оставшихся после сушки, должно в какой-то мере проявиться, в особенности если затирание начинается с низких температур, а также при применении «предварительного настаивания».
С другой стороны, известно, что добавление в практике затирания высокоферментативного солода (диафарина), т. е. солода, высушенного при низкой температуре, сопровождается повышением экстракта заторов, сбраживаемости и понижением вязкости сусла. Несомненно, причиной этого является действие упомянутых выше ферментов.
Комплекс протеолитических и цитологических ферментов благоприятствует распаду гемицеллюлоз и высвобождению крахмальных зерен, действие амилолитических ферментов на которые усиливается.
Автором в работе по переработке плохорастворимых солодов было показано, что добавление к затору 5—15% диафарина позволяет в тех случаях, когда солод не обеспечивает нормальной степени сбраживания, улучшить в известной мере процесс затирания.
При затирании этих солодов с добавлением диафарина были получены значительные сдвиги в благоприятную сторону в отношении конечной степени сбраживания, времени осахаривания и белкового распада; наблюдалось некоторое увеличение выхода экстракта и улучшение фильтрации.
Такие же результаты, несомненно, могут быть получены и с зеленым солодом, в котором комплекс протеолитических и цитолитических ферментов значительно сильнее. И.С. Орлинекий применял зеленый солод для улучшения сбраживаемости сусла, полученного из неполноценного солода. Добавление зеленого солода в количестве 5% к затору после отбора первой отварки при температуре 52° С позволило повысить сбражинасмость сусла и добиться получения нормального молодого пива в течение 5—5,5 сут.
Несомненно, распад крахмала благодаря действию цитазы в качестве форфермента протекал нормально, и сусло не содержало избыточных количеств высокомолекулярных несбраживаемых углеводов. Улучшался и белковый состав.
Запах и вкус затора, которые он приобретал непосредственно после добавления зеленого солода, устранялся при кипячении отфильтрованного сусла с хмелем, поэтому постороннего вкуса в пиве не осталось,