Побочные продукты брожения

12.04.2017
Главным продуктом спиртового, брожения, содержащимся в пиве, является этиловый спирт, слабый водный раствор которого почти безвкусен и поэтому не может оказывать значительного влияния на вкус пива; значительно более активными в этом отношении являются побочные продукты брожения: алифатические и ароматические спирты, эфиры карбоновых кислот, карбонильные и сернистые соединения, карбоновые кислоты и оксисоединения (альдегиды и кетоны).
Из высших спиртов, а их в сброженных продуктах найдено более 50, основную массу составляют изоамиловый, изобутиловый и пропиловый спирты — примерно 90%.
Механизм образования побочных продуктов брожения имеет большой теоретический и практический интерес, и многочисленные работы, проведенные и этом направлении только в последние три десятилетия, дали результаты, проверенные экспериментально и обладающие наибольшей вероятностью правильного решения этого вопроса.
Основываясь на работах Эрлиха, долгое время считали, что единственным путем образования высших спиртов является дезаминирование аминокислот.
Основной реакцией осуществления такого образования высших спиртов является

Здесь одновременно протекают два процесса: декарбоксилирование и гидролитическое дезаминирование.
Нейбауер и Фромгольц модифицировали эту схему. Они предложили дезаминирование до кетокислоты (через иминокислоту) как первую стадию получения высших спиртов.
Аминокислота сначала дегидрируется в иминокислоту и через реакцию с водой при отщеплении аммиака переходит в соответствующую ?-карбоновую кислоту, из которой путем декарбоксилирования образуется альдегид, который затем восстанавливается в соответствующий алкоголь.
Таким образом, из лейцина образуется изоамиловый спирт, содержание которого достигает 70% к общему количеству сивушных масел.
Из изолейцина образуется активный амиловый спирт, из валина— изобутиловый спирт. Таким же путем из тирозина образуется тирозол.
Тирозол обладает горьким вкусом и может придавать пиву ненормально горький вкус.
Аммиак, освобождающийся в результате указанных реакций, потребляется дрожжевыми клетками.
Торн показал, что в некоторых случаях последняя стадия высшего спирта может заканчиваться не реакцией восстановления, а реакцией окисления; в этом случае вместо спирта образуется кислота, например янтарная.
По Женевуа и Лафон, изовалериановая кислота непосредственно превращается в изоамиловый спирт.
Работы этих авторов подтверждают положение, что дрожжи могут синтезировать высшие спирты не только из аминокислот,
Стевенс указывает, что дрожжи способны синтезировать углеродный скелет аминокислот; на этой способности основано производство кормовых, пищевых и пекарских дрожжей. Безазотистые промежуточные соединения — кетокислоты (R*СО*СООН) могут подвергаться переаминированию или декарбоксилированию, превращаясь при этом соответственно в аминокислоты или альдегиды; из последних путем восстановления образуются высшие спирты. Как показал Торн, дрожжи, которые выращиваются в среде, богатой аминокислотами, например в пивном сусле, адсорбируют необходимые аминокислоты путем простой ассимиляции. При отсутствии их в среде дрожжи синтезируют углеродный скелет и, дезаминируя другие аминокислоты, получают азот, необходимый для завершения синтеза.
В пиве содержится ?-фенил этиловый спирт. Дрожжи способны продуцировать фенилаланин из сахаров и простых молекул, вероятно, из фенилпировиноградной кислоты.
Процесс образования высших спиртов рассматривается Эрлихом как самостоятельный, не связанный со спиртовым брожением, вместе с тем этот процесс является эндотермическим и без притока энергии извне осуществляться не может. Образование высших спиртов тесно связано с превращением аминокислот и и анаэробных условиях может протекать только одновременно со спиртовым брожением, являющимся поставщиком необходимой энергии. Действительно, в отсутствие брожения высшие спирты не накапливаются, если даже среда содержит углеводы.
По схеме Эрлиха кроме высшего спирта должен образовываться аммиак. В бродящей среде, однако, ни аммиак, ни аммонийные соли в количествах, которые бы соответствовали указанной схеме, не обнаруживаются. Таким образом, аммиак, отщепляющийся из аминокислот, должен связываться каким-нибудь продуктом спиртового брожения, И.Я. Веселов считает, что таким продуктом может быть пировиноградная кислота, которая как кетокислота согласно реакции перса минирования воспринимает на себя аминную группу аминокислоты, участвующей в реакции. Это показывает, что при использовании аминокислот среды нет процесса отщепления и образования аммиака, а есть только непосредственное потребление аминокислот, как таковых, и перенос аминных групп па новые углеродные цепи аминокислот, образуемые из продуктов превращения углеводов при спиртовом брожении.
Участие в реакциях переаминирования пировиноградной кислоты неизбежно должно приводить попутно с образованием высших спиртов к накоплению в среде эквивалентного количества ?-аланина, если он не расходуется па создание клетками биомассы дрожжей, и эквивалентного количества глицериновой кислоты или продукта ее превращения — ацетальдегида. Это положение подтверждено дальнейшими работами, проведенными И.М. Грачевой, которая показала, что введение пировиноградной кислоты в среду всегда вызывает почти пропорциональное повышение содержания высших спиртов, а добавление ?-аланина, ?-аминомасляной кислоты, глицина, валина, лейцина и изолейцина интенсифицирует процессы биосинтеза всех компонентов высших спиртов. Все это подтверждает неразрывную связь углеводного и азотистого обмена веществ в дрожжевой клетке,
И.Я. Веселов, исходя из отсутствия при спиртовом брожении свободного кислорода, считает правильным следующий путь образования янтарной кислоты, включающий и себя процесс переаминирования. Реакции, участвующие в этом превращении глютаминовой кислоты, протекают следующим образом:

Образовавшийся альдегид, вступая в окислительно-восстановительную реакцию с уксусным альдегидом, даст янтарную кислоту и этиловый спирт:

Изложенное показывает тесную взаимосвязь процессов брожения и образования продуктов превращения углеводов и аминокислот при спиртовом брожении, в результате которого в среде накапливаются высшие спирты, альдегиды и органические кислоты без участия свободного молекулярного кислорода.
Все сказанное о превращениях азотистых веществ сусла и накоплении побочных продуктов брожения указывает, что теория Эрлиха не может быть правильной. Исходя из теории экзотермичности биологических синтезов, развитой В.О. Таусоном, следует, что брожение является таким процессом превращения углеводов, в результате и в процессе которого образуются все необходимые строительные материалы для биосинтетических процессов в дрожжевой клетке. Таусон рассматривает брожение не как энергетический процесс, существующий в дрожжевой клетке наряду с пластическим, а как неудавшийся синтетический процесс, в котором спирт и углекислота являются отходами синтеза. При этом протекающие биологические реакции обеспечивают рост и развитие дрожжей. Такая постановка вопроса связывает в одно целое образование спирта и углекислоты с образованием побочных продуктов — альдегидов, сивушных масел, кислот и пр.
В зависимости от расы дрожжей содержание сивушных масел в пиве при главном брожении обычно колеблется в пределах 51—65 мг/л. В процессе дображивания количество их возрастает на 6—17 мг/л.
В состав сивушных масел входят эфиры, образование которых протекает по обычной реакции этерификации за счет спирта и кислоты:

Для выполнения этой реакция необходимо наличие катализаторов — дрожжевых эстераз, но так как реакция обратимая, то для осуществления се в одном направлении требуются водоотнимающие вещества. Кроме того, при наличии в среде сравнительно небольших концентраций спирта и кислот, особенно в начальных стадиях брожения, эта реакция трудно осуществима.
И.Я. Веселов отмечает, что эфиры накапливаются не только на конечной стадии брожения, но и па ранних стадиях, причем накопление их сопровождается заметным уменьшением концентрации альдегидов, в то время как уменьшения концентрации кислот не наблюдается. Поэтому он указывает, что более правильно считать, что эфиры образуются не за счет реакции между спиртами и кислотами, а за счет реакции между альдегидами, являющимися исходным материалом для образования этих продуктов:

Основная масса сивушных масел накапливается в период главного брожения к медленно увеличивается до конца брожения; в дальнейшем при дображивании количество сивушных масел незначительно увеличивается. Количество их прямо пропорционально интенсивности размножения дрожжей; при более высоких температурах брожения и при усиленной аэрации содержание их повышается.
Большое значение в образовании сивушных масел имеют автолитические процессы брожения.
Ацетоин, бутандиол и диацетил не входит в состав сивушных масел, его являются продуктами брожения. В табл. 88 показано содержание диацетила, ацетоина и бутандиола в пиве разных сортов Останкинского пивоваренного завода (по М.Т. Денщикову и С.С. Рылкину).

Количество диацетила в пиве подвержено большим колебаниям. В светлом пиве, вырабатываемом в ФРГ, содержится диацетила (в мг/л): в среднем 0,07, в пильзенском — 0—0,13, в более крепких сортах — до 0,17. В английском пиве диацетила найдено 0,02—0,08 мг/л, в эле — 0,10—0,30 мг/л. В американском пиве содержание диацетила достигает 1 мг/л.
Повышение содержания диацетила до 0,5 мг/л придает пиву характерный медовый привкус и запах.
Появляющиеся в пиве вкус и запах диацетила могут быть связаны с инфицированием пива особым видом сарцин, так как этот микроорганизм продуцирует диацетил. Однако и культурные дрожжи способны образовывать это соединение; были получены расы дрожжей, которые могут выделять большие количества диацетила.
Некоторые авторы связывают образование диацетила дрожжами с синтезом валина и исходным продуктом его образования считают пировиноградную кислоту, которая при участии кофермента А, обладающего функцией ацетилирования, ацетилируется в ацетомолочную кислоту, а из нее путем декарбоксилирования образуется ацетоин, который окисляется в диацетил:

Из ацетомолочной кислоты может быть получен валин; это свидетельствует о связи метаболизма валина с образованием диацетила и подтверждается экспериментально: добавление валика при брожении уменьшает содержание диацетила в пиве.
Как видно из схемы, последние три продукта представляют собой три ступени окисления общего строения. Первые два (2,3-бутан-диол и ацетоин) являются нормальными продуктами брожения и находятся в пиве в значительных количествах. При дальнейшем окислении этих продуктов образуется диацетил, который находится в пиве в небольших количествах.
Образование диацетила наблюдается в первой стадии брожения, когда дрожжи сильно размножаются и происходит энергичный азотистый обмен веществ. Каждое мероприятие, сопровождающееся превращением анаэробного процесса в аэробный, способствует образованию диацетила.
М.Т. Денщиков и соавторы, внося диацетил в сусло в период энергичного размножения дрожжей, установили, что новообразование диацетила в среде резко уменьшалось. Для объяснения этого явления они считают наиболее вероятными две возможности; первая — в процессе энергичного размножения дрожжей происходит восстановление диацетила в ацетоин; вторая — использование диацетила в биосинтезе веществ дрожжевой клетки. Хроматографический анализ показал, что в случае наличия в исходной среде диацетил а дрожжи потребляют больше аминокислот, чем в контроле, в том числе и лейцинов.
Большой интерес представляют исследования, посвященные вопросу влияния сивушных масел и диацетила на дрожжи. При наличии в бродящем сусле 0,1% изоамилового спирта рост дрожжей замедляется, а при содержании его 0,7% полностью прекращается. Брожение значительно замедляется при содержании изоамилового спирта 0,3% и совершенно прекращается в том случае, если его количество повышается до 0,6%. Однако практически такого количества этого спирта в пиве не получается, поэтому может наблюдаться лишь замедление процесса брожения.
Как установили Коцкова-Кратохвилова с соавторами, диацетил действует на дрожжи в 60 раз сильнее, чем фенол в такой же концентрации. Энергия размножения дрожжей находится в обратной, а процентное содержание мертвых клеток — в прямой зависимости от концентрации диацетила.

В практику бродильных производств глубоко вкоренился термин «сивушные масла», в который включается понятие о сумме почти всех побочных продуктов брожения. Их состав и характер вкусовых ощущении зависят от того, какие органические соединения подверглись брожению и какие микроорганизмы осуществляли этот процесс, т. е. состав сивушных масел определяется природой сбраживаемого субстрата и сбраживающих его микроорганизмов (дрожжей).
Широкое изучение состава сивушных масел началось со времени применения для их определения методов газовой хроматографии. Первыми работами в этом отношении следует считать изыскания Энебо.
Как указывалось выше, большая часть сивушных масел образуется в самом начале процесса брожения пивного сусла, а при дображиваним увеличение их количества значительно сокращается.
В готовом пиве московских заводов основные высшие спирты (пропилоный, изобутиловый, активный амиловый и изоамиловый) содержатся в пределах (в мг/л): в Жигулевском 60— 110, в Рижском 75—130, в Московском 90—180.
По данным Энебо, в шведском пиве содержится пропилового спирта 2,9 мг/л, изобутилового 3,9 мг/л и активного амилового + изоамилового 44 мг/л. По анализам Л.Г. Шмидта и Т.П. Рыжовой, содержание высших спиртов в зарубежном пиве колеблется от 45 до 104,1 мг/л, в пиве отечественном (рядовом) — от 39,82 до 146,08 мг/л.
Этими авторами установлено, что увеличение количества побочных продуктов в период главного брожения и выдержки пива характеризуется данными, приведенными в табл. 89 и 90.

Количество этилацетата во время выдержки увеличилось на 23%.
?-фенилэтиловый спирт в пиве содержится в значительных количествах и оказывает влияние па его вкус и аромат. По данным Шмидта и Рыжовой, в разных сортах отечественного пива ?-фениловый спирт содержится в количестве от 19,96 до 47,04 мг/л.
О количестве летучих и нелетучих соединений в готовом пиве можно судить по данным Энебо, который исследовал шведское пиво разных сортов, полученное при низовом и верховом брожении (табл. 91).

Сырье и продукты пивоварения содержат сернистые соединения. В состав этих соединений входят сероводород, сернистый ангидрид и меркаптан. Последний относится к группе тиофенолов к обладает неприятным запахом, причем этот запах может быть обнаружен в очень большом разаведении (одна часть на сотни миллионов частей). Как установил Бреннер с сотрудниками, в сырье, особенно в хмеле, меркаптан содержится в довольно значительном количестве.

Летучие сернистые соединения могут образовываться химическим путем во время изготовления сусла, особенно при кипячении, например при реакции метионина с карбонильными соединениями, при метаболизме дрожжей и других микроорганизмов, если они имеются в сусле или пиве.
Следует отметить, что летучие сернистые соединения, образующиеся во время затирания и кипячения, из цистеина и метионина удаляются только после кипячения сусла в течение 3,5 ч.
Содержание сернистых соединений во время брожения понижается, а при выдержке пива вновь повышается.
Содержание их в пине при нормальном протекании технологического процесса невелико (5—15 мг/л); в случае превышения указанной величины пиво приобретает неприятный вкус и особенно запах. Наличие этих соединений в пиве зависит от состава сырья, интенсивности кипячения сусла и содержания их в дрожжах, Флокулирующие дрожжи содержат 970 мг/л меркаптана, а пылевидные 500. Изменения количества сернистых соединений во время технологического процесса, полученные Масшелейном, показаны в табл. 92.

В процессе выдержки пива количество меркаптана почти не уменьшается, но при промывании пива углекислотой содержание меркаптана значительно снижается (от 860 до 3,9 мг/л).