Молекулярные каскады в процессе консолидации памяти

10.09.2016
Для исследования изменений содержания белков, которые появляются в сенсорных нейронах аплизии при обработке их серотонином, использовали количественный двухмерный электрофорез в геле. Он показал наличие трех разделенных во времени моментов увеличения содержания специфических белков. В течение первого часа экспозиции с серотонином или после появления цАМФ в этих нейронах появляется группа из 10 белков. За этим ранним изменением в содержании специфических белков следуют еще две «белковые волны». Пик второй «волны» наступает спустя три часа, в то время как пик третьей группы белков достигает своего устойчивого уровня более медленно. Появление каждой из этих групп белков требует синтеза РНК, указывая на то, что данные изменения имеют место на уровне регуляции транскрипции. Таким образом, долговременная фасилитации у аплизии вызывает каскад активаций генов. Этот процесс имеет много общего с активацией генов факторами роста.

Были идентифицированы ранние гены, которые вовлекаются во время этих трех волн белкового синтеза. Индукция мРНК наблюдается даже в присутствии ингибиторов белкового синтеза, что является важной характеристикой ранних генов — fos, jun и zif268. Таким образом, некоторые гены, появляющиеся в результате активации фактора транскрипции (CREB), сами являются транскрипционными факторами, вовлекающими каскад данных факторов.

Торможение функции гидролаз с помощью инъекции антител в сенсорный нейрон блокирует долговременную фасилитацию, но не влияет на кратковременные процессы. Методом инъекции в сенсорные нейроны олигонуклеотида, имеющего соответствующее место связывания, в различные интервалы после обработки серотонином было установлено, что для блокирования долговременных процессов консолидации памяти необходимо длительное время. При инъекции этого олигонуклеотида в сенсорный нейрон через 1, 6 или 9 часов после обработки серотонином степень торможения фасилитации изучали в течение 24 ч. Олигонуклеотид не оказывал влияния на фасилитацию только через 12 ч после обработки серотонином. Таким образом, через 12 ч с момента обработки серотонином синаптическая фасилитация уже не зависела от активности ранних генов. Эти данные показали, что определенные ранние гены отвечают за молекулярные компоненты фазы консолидации, которая приводит к экспрессии эффекторных генов, а они, в свою очередь, были необходимы для стабилизации долговременного хранения памяти. Стабилизация достигается, возможно, ростом новых синаптических связей, а некоторые из эффекторных генов могут играть важную роль в формировании новых синапсов.

Тип эксплицитной памяти в настоящее время связывают с нашей способностью, например, запоминать лица, места и объекты. Субстратами этого вида памяти являются гиппокамп и медиальная височно-лобная система головного мозга. По мере развития экспериментальной техники, которая позволяет получать трансгенных животных, становится все более очевидным, что мыши являются прекрасной генетической системой для изучения роли продуктов отдельного гена в синаптической пластичности и хранении памяти.

У грызунов пространственное и контекстуальное (contexual) обучение особенно хорошо документировано. Известно, что эти формы обучения чувствительны к разрушению гиппокампа. Oпpeделенные физиологические свойства гиппокампа грызунов также потенциально важны, как и те клеточные механизмы, которые могут лежать в основе хранения памяти. Во-первых, на уровне гиппокампа осуществляется клеточный механизм обучения — долговременная потенциация, которая, как считают, может участвовать в некоторых аспектах пространственной памяти. Специальные исследования на крысах показали, что отдельные нейроны гиппокампа активируются, если животное находится в строго определенном месте пространства экспериментального лабиринта. Эти данные позволили выдвинуть гипотезу, что в гиппокампе сформирована пространственная карта.

В гиппокампе, как и в абдоминальном ганглии аплизии, поздняя фаза синаптической пластичности может быть охарактеризована в физиологических, молекулярных и генетических терминах. Изменение этой поздней фазы у млекопитающих избирательно отражается в дефиците долговременной гиппокампзависимой памяти. Для всех форм обучения имеются доказательства существования по крайней мере двух стадий памяти — кратковременной и долговременной. Более того, обе стадии представлены на клеточном уровне: кратковременная вовлекает ковалентную модификацию предсуществующих белков, долговременная фаза — транскрипцию и синтез новых белков.

До сих пор описывались положительные регуляторные механизмы, определяющие переход от кратковременной к долговременной синаптической фасилитации. Оказалось, что молекулярные механизмы этих процессов сходны с регуляторными механизмами роста и развития клеток. В этих процессах принимают участие ранние гены (онкогены), такие, как mус и src, которые кодируют белки, приводящие к делению клетки.

Онкогены, которые исходно были идентифицированы как гены, переносимые вирусами, являются причиной трансформации клетки. Однако вскоре было обнаружено, что эти гены могли быть результатом мутации нормальных клеточных генов. Например, рост опухоли происходит в результате увеличения или изменения активности генного продукта, что приводит к нарушению регуляции в некоторых компонентах путей роста клеток. Исследование контроля роста клетки привело к открытию группы генов, продукты которых подавляют деление клетки. Некоторые опухоли, например опухоль сетчатки, известная как ретинобластома, возникает в результате утери обоих аллелей этого гена в локусе. Эта рецессивная болезнь, наследуемая генетически, происходит в результате соматической мутации, причиной которой является инактивация генов, подавляющих опухолевой рост. Такие гены в норме предотвращают деление клеток. Гены, подобные тем, которые вызывают ретинобластому, были идентифицированы по утере способности клеток к пролиферации.

Исследования последних лет показали также, что негативные регуляторные механизмы важны и во время эмбрионального развития. Они предотвращают попадание клетки в определенные пути дифференцировки. Эти данные подняли вопрос: имеются ли подобные тормозные регуляторные механизмы, которые выступают как гены-супрессоры памяти, и могут ли они участвовать в роли модуляторов памяти?

Исследования последних лет показали, что переход от кратковременной фасилитации к долговременной у аплизии вызывает инактивацию генных продуктов, что выражается в торможении консолидации памяти. Долговременная фасилитация требует не только позитивных регуляторных механизмов для запуска факторов транскрипции (CREB), но и сопутствующего удаления некоторых тормозных ограничителей. Были выделены три главных тормозных ограничителя: освободитель репрессии с помощью CREB2, поддерживающаяся активация ПК А в результате регулируемого протеолизиса регуляторных субъединиц ПК А и удаление ингибитора синаптического роста. Рассмотрим каждый из них отдельно.

Эксперименты, направленные на изучение молекулярной характеристики фактора транскрипции (CREB) у аплизии, дали ясные доказательства существования репрессивных механизмов, которые препятствуют процессу консолидации. Семейство регуляторных белков транскрипции принадлежит более обширной группе ДНК-связывающих белков. Благодаря этому возможна весьма эффективная регуляция порога долговременной фасилитации уже на ранних стадиях. Это означает, что долговременные процессы консолидации находятся под двойным контролем: активируются и репрессируются специальными белками.

Возможно, CREB критически необходим для включения формирования долговременной памяти, и возрастание активности CREB при помощи сверхэкспрессии активатора изоформы или торможения репрессорной изоформы в результате приводит к обучению типа озарения, или инсайта. Человек демонстрирует также фотографическую память, часто связанную с историческими событиями или чрезвычайными событиями собственной жизни. Важно то, что восприятие этих событий было окрашено эмоционально. Такие «вспышки» памяти, особенно детальные и яркие воспоминания, могут сохраняться всю жизнь. Заманчиво предположить, что семейство CREB-молекул, регулирующих транскрипцию, может принимать участие в подобной феноменологии памяти человека.

По результатам исследований на клеточном уровне (как на аплизии, так и млекопитающих) была выдвинута гипотеза, предполагающая, что память формируется за счет роста новых синаптических связей. Например, в рефлексе отдергивания жабры у аплизии возникшая долговременная сенситизация вызывает структурные изменения в сенсомоторном синапсе уже после приложения пяти импульсов серотонина. Эта процедура приводила к 50%-му увеличению площади синаптического контакта. Подобный рост новых синаптических связей между сенсорным и моторным нейронами может быть индуцирован в интактном ганглии внутриклеточной инъекцией цАМФ или обработкой нейрона серотонином. Появление новых синапсов протекало параллельно функциональной синаптической фасилитации. Все структурные изменения блокировались ингибиторами РНК или ингибиторами белкового синтеза. Интересно, что подобные структурные изменения во время долговременной фасилитации можно было вызвать одним импульсом серотонина после связывания специфическими антителами белка, тормозящего формирование памяти. Методом флуоресцентной метки варикозов сенсорного нейрона было показано, что сочетание одиночного импульса серотонина с инъекцией специального белка действует как на морфологический репрессор, так и на функциональные изменения, которые сопровождают долговременную фасилитацию.

Были описаны структурные изменения на двух разных уровнях синаптической организации, вызванные долговременной сенситизацией. Во-первых, сенситизация приводит к увеличению количества и размеров везикул в активной зоне сенсорного нейрона. Во-вторых, происходит приблизительно двоекратное увеличение общего количества пресинаптических варикоз, и это явление распространяется на аксональные разветвления каждого сенсорного нейрона (рис. 6.18). Все описанные изменения наблюдали только в пресинаптической клетке. Увеличение количества активных зон и варикозов сохраняется до трех недель. Это показывает, что увеличение количества синапсов — наиболее вероятное структурное изменение, которое вносит свой вклад в поддержание долговременной сенситизации. Важность структурных изменений синаптической пластичности подчеркивается наблюдением, что при блокировании специального нейропептида утрачиваются синаптические варикозы пресинаптического (сенсорного) нейрона.
Молекулярные каскады в процессе консолидации памяти

Изменения в генной экспрессии и белковом синтезе включаются в этот процесс ковалентной модификацией предсуществующих протеинов, таких, как CREB, что приводит к росту новых синаптических связей. Из исследований в области биологии развития (эмбриологии) было хорошо известно, что на ранних стадиях развития зародыша большую роль играют специальные белки адгезии. Из работ на аплизии сейчас ясно, что этот класс поверхностных белковых молекул может принимать непосредственное участие в формировании синапса и процессах консолидации следа памяти. У других видов (от дрозофилы до мыши) молекулы клеточной адгезии также принимают участие в синаптической пластичности.

Вывод, который следует из описания сложнейшей внутриклеточной машинерии, состоит в утверждении, что процесс консолидации памяти вовлекает положительные и отрицательные регуляторные механизмы. Исходно было показано, что для хранения следа памяти необходим белковый синтез. Начался поиск специфического гена и белков, которые участвуют в этом процессе. Он привел к идентификации трех классов генов: (1) конституативных (constitutively) генов, экспрессирующих транскрипционные факторы; (2) каскада ранних генов, которые включают раннюю фазу консолидации; (3) генов, экспрессирующих факторы роста. Последняя фаза включает в свой состав трансмембранные белки, но она пока плохо изучена. Результатом молекулярных каскадов являются консолидация долговременной памяти и рост новых функциональных синаптических связей.

Интересно, что каждая из трех названных выше стадий имеет тормозные ограничители, обеспечивающие множественные точки контроля.

Почему существуют супрессорные гены памяти? Долговременная память вовлекает каскад генных экспрессий, как было показано в данной главе на примере долговременной фасилитации у аплизии. Этот каскад приводится в действие ПК А, но только в пределах 12 ч после индукции синаптическая потенциация становится стабильной и независимой от активности как ПК А, так и ранних генов. Во время этого периода консолидации необходимо проконтролировать, станет ли фасилитация постоянной. Генные супрессоры, например опухоли, часто функционируют как контрольные точки, позволяя различным сигналам интегрироваться в единый клеточный ответ — деление клетки. Сходным образом гены-супрессоры памяти могут обеспечить контрольные точки хранения, гарантирующие запоминание (выучивание) только необходимых свойств.

Удаление тормозных ограничителей может быть особенно важно в определении продолжительности хранения памяти. Активация позитивных регуляторных механизмов и удаление тормозных ограничителей могут протекать с различными временными характеристиками. Эта разная кинетика может играть критическую роль в определении продолжительности хранения следа памяти. Интригует предположение, что продукты генов-супрессоров памяти могут быть выключены специальными фармакологическими воздействиями, что очень важно, например, для предотвращения утери памяти при болезни Альцгеймера.

Наше обсуждение многочисленных позитивных и негативных механизмов долговременной памяти указывает на важность геномной регуляции и поднимает вопрос: почему геномные изменения происходят только в определенных синапсах? Временные модификации в синапсе в период кратковременной памяти могут быть меткой для данного синапса. В результате нового белкового синтеза, направленного к этому синапсу, вновь синтезированный белок может быть активен вблизи данного синапса. Можно предположить также, что новый белковый синтез будет происходить локально в ответ на соответствующий сигнал потенциации. Таким образом, проблема специфичности синапса может рассматриваться как специальный случай более общей проблемы биологии клетки — как белки «метят» определенные субклеточные локусы, например, для консолидации следов памяти в нейронных сетях.