Биологическое действие свободных радикалов кислорода

05.08.2016
Токсические эффекты


В основе многообразия эффектов активированных форм кислорода на метаболизм клеток лежит их чрезвычайно высокий окислительный потенциал, позволяющий быстро реагировать с разнообразными по своей природе органическими соединениями, содержащимися в тканях.

А. Липиды мембран, перекисное окисление липидов


Среди эндогенных клеточных субстратов, наиболее быстро вступающих в реакции со свободными радикалами кислорода, важнейшее место занимают полиненасыщенные (т. е. содержащие много двойных связей) —С=C— жирные кислоты, входящие в состав главным образом фосфолипидов мембран. Причем с увеличением числа двойных связей (степени ненасыщенности) быстрота окисления жирных кислот возрастает. Это взаимодействие свободных радикалов кислорода с ненасыщенными жирными кислотами дает начало их цепному свободнорадикальному окислению, в ходе которого образуются перекисные соединения. Отсюда этот процесс в целом получил название свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Инициация ПОЛ в липидах мембран начинается с «атаки» полнненасыщенных жирных кислот каким-либо свободным радикалом кислорода, достаточно активным для того, чтобы «отнять» атом водорода у одной из —CH2— групп углеродной цепи. Такой способностью, вероятнее всего, обладает ОН- (возможно, и 1O2), но не O2 и тем более не H2O2. Поскольку атом водорода имеет только один электрон, его удаление приводит к образованию одного неспаренного электрона на атоме углерода, подвергшемся свободнорадикальной атаке. В результате образуется углеродный радикал —CH— в молекуле липида и, следовательно, липидный радикал
Биологическое действие свободных радикалов кислорода

Липидные радикалы благодаря внутримолекулярным перестройкам превращаются в конъюгированные диены, которые, вступая в реакцию с молекулярным кислородом, образуют перекисные радикалы (—CH—):
Биологическое действие свободных радикалов кислорода

Перекисные радикалы способны сами отнимать атом водорода от других липидов, давая в итоге гидроперекиси липидов и липидные радикалы:
Биологическое действие свободных радикалов кислорода

Таким способом поддерживаются цепные реакции ПОЛ. Гидроперекиси липидов в физиологических условиях являются относительно стабильными соединениями. Главную роль катализаторов их распада играют металлы переменной валентности (прежде всего железо и медь). В их присутствии из гидроперекисей образуются алкоксильные (липид—О*) или новые липидные перекисные радикалы (липид-О2*). Как алкоксильные, так и перекисные радикалы продолжают цепные реакции ПОЛ, «отбирая» атомы водорода от ненасыщенных жирных кислот. Этот процесс в принципе может продолжаться до тех пор, пока не произойдет полного окисления жирных кислот, входящих в состав липидов. Однако в реальной ситуации этого не происходит из-за наличия в тканях антиоксидантов, к которым относятся соединения различной химической природы, способные замедлять или предотвращать свободнорадикальное окисление органических веществ молекулярным кислородом.

Помимо того, что гидроперекиси липидов могут являться источниками перекисных радикалов, сами гидроперекиси способны подвергаться нерадикальным окислительным превращениям, что приводит к появлению промежуточных (диеновые конъюгаты, диальдегиды) и конечных продуктов ПОЛ (основания Шиффа, летучие углеводороды), а также спиртов, кетонов и альдегидов. Образующиеся в процессе ПОЛ, протекающего в мембранах, химические соединения обладают биотоксическим действием и их избыточное накопление в тканях может оказать негативное влияние на функцию и структурную целостность клеточных и субклеточных мембран. Это мембраноповреждающее действие продуктов ПОЛ опосредуется следующими механизмами.

1. При чрезмерной активации ПОЛ, когда перекисной окислительной деградации подвергается значительная часть мембранных фосфолипидов, липидная фаза мембраны становится более ригидной. Это ограничивает конформационную подвижность полипептидной цепи, вследствие чего снижается функциональная активность ферментов, рецепторов и каналообразующих белков, встроенных в мембраны. Этому способствует образование межлипидных, межбелковых и липид-белковых поперечных сшивок за счет взаимодействия со вторичными продуктами ПОЛ, и, в частности, с малоновым диальдегидом (рис. 17). Подобный ход событий, сопровождающихся, например, подавлением активности Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума, приводит к нарушению удаления Ca2+ из саркоплазмы и реализации повреждающего действия избытка этого катиона на кардиомиоциты.

2. Увеличению внутриклеточной концентрации Ca2+ способствует и усиление проникновения этого катиона в клетку из внеклеточной среды. Это связано с тем, что при ПОЛ в гидрофобном «хвосте» жирной кислоты появляется гидрофильная перекисная группа. Если в каждом из монослоев мембраны комплексы таких окисленных фосфолипидов оказываются расположенными друг против друга, то в мембране образуются каналы повышенной проницаемости (кластеры), проходимые, в частности, для Са2+. Чрезмерное увеличение количества таких кластеров может стать основой фрагментации и разрушения мембран сарколеммы и саркоплазматического ретикулума (рис. 17).
Биологическое действие свободных радикалов кислорода

3. Появление в гидрофобной области липидного бислоя мембран гидрофильных перекисных групп как бы «разрыхляет» эту область и делает присутствующие в ней белковые компоненты более доступными для протеолитических ферментов. Это также способствует разрушению биомембран.

4. Прямое окисление сульфгидрильных групп в активных центраx ферментов (в том числе и ферментов, локализованных в мембранах); следствием этого является инактивация этих ферментов и увеличение проницаемости мембран.

5. Разрушение веществ, обладающих антиоксидантной активностью (витаминов, стероидов, убихинона).

Из сказанного следует один важный вывод: вследствие несбалансированной активации ПОЛ, индуцированной свободными радикалами кислорода, возникает повреждение плазматических мембран, а также мембран внутриклеточных органелл — митохондрий, саркоплазматического ретикулума и лизосом. Это приводит к угнетению окислительного фосфорилирования, ингибированию транспорта Ca2+ и высвобождению лизосомных аутолитических ферментов, глубоким расстройствам функции и в конечном итоге — к гибели клетки.

Однако взаимодействие с липидами мембран — отнюдь не единственный путь влияния свободных радикалов на биообъекты.

Б. Белки


Из-за того, что ненасыщенные и содержащие серу молекулы белков хорошо реагируют со свободными радикалами кислорода, белки, в состав которых входят аминокислоты триптофан, тирозин, фенилаланин, гистидин, метионин и цистеин, будут подвергаться соответствующей модификации при свободнорадикальной атаке. Поэтому активность такого, например, важного фермента гликолиза, как глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, и ряда других ферментов, активность которых зависит от указанных аминокислот, ингибируется под действием активных форм кислорода.

Свободные радикалы кислорода могут вызывать образование поперечных связей посредством дисульфидных мостиков в цитоплазматических и мембранных белках. Еще более серьезные последствия возникают при формировании межмолекулярных сшивок между продуктами ПОЛ (например, малоновым диальдегидом) и аминокислотными остатками белков.

В результате реакций свободных радикалов с белками могут возникать побочные продукты, которые будут усиливать повреждения, вызванные начальными реакциями взаимодействия этих агрессивных агентов с липидами. Так, окисление триптофана приводит к образованию N-формилкинуренина и H2O2. Первый из этих продуктов может реагировать с аминосодержащими соединениями, способствуя образованию поперечных связей между липидами и белками и давая в итоге основания Шиффа, составляющие основу пигмента изнашивания липофусцина.

Из 20 аминокислот, встречающихся в типичных животных белках, особенно уязвимыми для свободных радикалов кислорода, и в частности, для синглетного кислорода являются гистидин, триптофан, метионин, тирозин и цистеин.

Одним из неблагоприятных последствий свободнорадикального окисления белков является отрыв электрона от некоторых молекул (например, серы) с образованием свободнорадикальных интермедиатов, способных атаковать другие молекулы. Чувствительность белков к свободнорадикальному повреждению зависит от их аминокислотного состава и способности к репарации.

He только мембранные, но и цитозольные белки подвергаются модификации под действием активированных форм кислорода. В качестве примера можно указать на тот факт, что в присутствии двухвалентного железа O2' и H2O2 превращают оксигемоглобин в метгемоглобин. С этим же связано подавление под влиянием супероксида активности такого цитоплазматического гемопротеида, как каталаза.

В. Нуклеиновые кислоты


Одним из важных проявлений цитотоксического действия свободных радикалов кислорода считается их мутагенный эффект, опосредованный главным образом гидроксильным радикалом, а также, возможно, и синглетным кислородом. Цитотоксичность ОН* есть следствие хромосомных аберраций, возникающих в результате либо модификации азотистых оснований нуклеиновых кислот, либо разрыва двойной спирали ДНК. Гидроксильный радикал прямо реагирует с дезоксирибозой и основаниями нуклеиновых кислот.

Образующийся в процессе ПОЛ малоновый диальдегид из-за своей способности диффундировать может проникать в ядро клетки и реагировать с азотистыми основаниями ДНК, что позволяет рассматривать его тоже в качестве одного из мутагенных агентов.

Г. Внеклеточные эффекты


Среди внеклеточных компонентов, которые подвергаются особому риску свободнорадикальных повреждений, прежде всего следует назвать коллаген и гиалуроновую кислоту. Супероксидный анион-радикал в условиях in vitro усиливает неэнзиматический распад пептидов, входящих в состав коллагена. Под влиянием O2 наблюдается деполимеризация гиалуроновой кислоты — полисахарида, входящего в состав внеклеточного основного вещества соединительной ткани. И, наконец, свободные радикалы кислорода играют ведущую роль в модулировании степени воспалительной реакции и последующих тканевых повреждений в связи с их непосредственным участием в фагоцитарной функции лейкоцитов, о чем будет сказано ниже.

Д. Токсическое действие свободных радикалов кислорода на сердечно-сосудистую систему


Отмеченные выше метаболические эффекты генерируемых в избытке активированных форм кислорода не могут не отразиться на функциональном состоянии сердечно-сосудистой системы.

Одним из прямых аргументов в пользу того, что свободнорадикальные формы кислорода могут вызывать повреждения клеток миокарда и что одним из путей реализации этого эффекта может быть активация ПОЛ, являются данные Барсачи с соавторами, обнаруживших, что введение Н2O2 в буферный раствор, которым перфузировали изолированные сердца крыс, приводило к увеличению интенсивности спонтанной хемолюминесценции сердец и возрастанию концентрации малонового диальдегида в миокарде и перфузате. Как полагают авторы, при реакции H2O2 с металлами переменной валентности, локализованными в интра- и экстрацеллюлярном пространстве, образуется гидроксильный радикал, вызывающий посредством активации ПОЛ ухудшение сократимости изолированных сердец и развитие в них коагуляционного миоцитолиза.

В опытах Буртона с соавторами, выполненных на изолированных межжелудочковых перегородках крыс, было продемонстрировано прямое повреждающее действие свободных радикалов O2 на структуру и функцию сердца. Перфузия межжелудочковых перегородок вместе с пурином и ксантин-оксидазой, обеспечивающими генерацию O2 , приводила к развитию умеренных структурных повреждений сосудистого эндотелия и клеточных мембран, не сопровождавшихся нарушением сократительной функции миокарда. Перфузия перегородок с пурином, ксантиноксидазой и трансферрином, содержащим Fe3+ (что обеспечивало генерацию не только O2, но и CH-), вызывала развитие более выраженных повреждений эндотелия сосудов и сарколеммальных мембран, сопровождающееся резкой депрессией сократительной функции миокарда.

Имеются также данные о прямом повреждающем эффекте продуктов ПОЛ на изолированные клетки и субклеточные структуры сердца. В частности, гидроперекись линолеата при ее действии на изолированные митохондрии сердца крысы в концентрации 100—140 нМ/мг белка полностью ингибировала окислительное фосфорилирование, а дигидроперекиси метиллинолеата при окислении глутамата и малата ингибировали транспорт электронов.

Активация ПОЛ в изолированных клетках сердца крысы вызывала их контрактуру, разрушение миофиламентов и набухание митохондрий. К сказанному можно добавить, что сарколемма кардиомиоцитов более чувствительна к свободнорадикальному повреждению, чем мембраны микросом, вследствие более высокого содержания в ней ненасыщенных жирных кислот.

Свободные радикалы кислорода способны также разрушать гиалуроновую кислоту и коллаген — составные части сосудистых базальных мембран и экстрацеллюлярного матрикса.

Можно упомянуть еще об одном механизме, посредством которого свободные радикалы через ПОЛ могут участвовать в генезе ишемических повреждений сердца. Обнаружено, что инъекция гидроперекиси линолевой кислоты в левый желудочек крысы вызывала повреждение эндотелия, агрегацию тромбоцитов и прилипание лейкоцитов к стенке коронарных артерий, а также ишемические изменения на ЭКГ. Исходя из этих и ряда других данных можно думать, что продукты ПОЛ могут быть одной из причин вазоконстрикторной реакции мелких сосудов (в том числе и коронарных) и способствовать тромбообразованию.

Физиологические эффекты


Резюмируя изложенные выше данные о токсическом действии свободных радикалов кислорода, следует еще раз подчеркнуть, что эти радикалы представляют собой продукт нормального клеточного метаболизма живых систем, существующих в условиях аэробиоза. Повреждающее действие активированных форм кислорода на ткани реализуется лишь при определенных условиях. Важнейшим из этих условий является значительное превышение против физиологической нормы стационарной концентрации в клетке или самих радикалов или токсических продуктов их взаимодействия с соответствующими клеточными компонентами. О регуляции безопасного для клетки уровня свободных радикалов и продуктов их метаболизма, а также о системах, принимающих непосредственное участие в этой регуляции, будет сказано ниже. Здесь же хотелось бы акцентировать внимание на том обстоятельстве, что как сами активированные формы кислорода, так и продукты их окислительных превращений отнюдь не являются абсолютно «вредными» для клетки веществами, а, напротив, утилизируются клетками и играют важную роль в некоторых биосинтетических, дезинтоксикационных реакциях, а также в модификации функции мембран в ответ на действие экстремальных раздражителей.

Надо отметить, что действие оксигенных радикалов и инициируемый ими процесс ПОЛ затрагивает как липиды, располагающиеся в бислойных областях мембран, так и липиды, формирующие микроокружение мембраносвязанных белков. Поэтому мембраносвязанные белки, структурно-функциональная организация которых во многом определяется свойствами липидного микроокружения, весьма чувствительны к действию свободных радикалов. Из литературы известно, что ПОЛ может оказывать не только повреждающее, но и модифицирующее влияние на многие интегральные белки (ферменты) мембран: цитохром Р-450, цитохром b5, глюкозо-6-фосфатазу, аденилатциклазу, моноаминоксидазу, компоненты электронтранспортной цепи митохондрий, а также транспортные АТФазы.

Одним из проявлений физиологической роли умеренной активации ПОЛ является увеличение проницаемости сарколем мальной мембраны для Ca2+ при одновременной активации ферментов, в частности, Ca—АТФазы, ответственной за удаление Ca2+ из цитоплазмы и расслабление миокарда. Показано, что эта активация фермента, способствующая улучшению сократительной функции сердечной мышцы, происходит именно за счет накопления гидроперекисей фосфолипидов (первичных молекулярных продуктов ПОЛ), обладающих детергентоподобным эффектом.

Поскольку образование окисленных липидов ускоряет их утилизацию с помощью фосфолипаз и белков-переносчиков, а также сопровождается элиминацией из мембран легкоокисляемых и пополнением трудноокисляемыми липидами, то усиление перекисных окислительных процессов в липидах приводит к изменению состава липидов мембран. Это с неизбежностью отражается на функциональном состоянии мембраны, ее «текучести». Снижение активности ПОЛ вызывает переход липидов в более «жидкое» состояние, тогда как увеличение ПОЛ делает липидную фазу мембран более ригидной, что, естественно, приводит к изменению активности мембраносвязанных липидзависимых ферментов (аденилатциклазы, фосфодиэстеразы, Na, К-АТФазы). ПОЛ, следовательно, в данном случае выступает в роли важного фактора обновления состава липидов мембран, модификации их функций и перехода клетки из одного состояния в другое в соответствии с характером возмущающего воздействия.

Другим важным фактором, на который оказывает влияние усиление продукции оксигенных радикалов, является изменение активности некоторых оксигеназных реакций и зависимых от них звеньев метаболизма. Подобный тип реакций катализируется специальными ферментами — оксигеназами. Примечательно, что одна из сравнительно недавно открытых оксигеназ — индолеаминдиоксигеназа — требует и утилизирует для своей каталитической активности супероксидный анион-радикал. По этой причине данный фермент был отнесен к классу «супероксигеназ». Индолеаминдиоксигеназа катализирует окислительный распад индольного кольца триптофана и других производных индолеаминов (соединений, содержащих индольное кольцо и аминогруппу) — таких, например, как серотонин, триптамин, мелатонин. В качестве продукта этой реакции образуется новый тип биогенных аминов, обладающих уникальными свойствами и называемых антранилоиламинами:
Биологическое действие свободных радикалов кислорода

Согласно недавно высказанной гипотезе, эти биогенные амины вовлекаются в гуморальные защитные реакции при различных патологических ситуациях. Предполагается, в частности, что возникающие при участии супероксидного аниона-радикала продукты обмена индолеаминов могут играть важную роль при воспалении, в иммунных реакциях, модификации действия интерферона. Один из путей вовлечения биогенных аминов в защитные реакции при воспалении показан на рис. 18. Проникновение вирусов или бактерий в легкие и их взаимодействие с полиморфно-ядерными лейкоцитами и лимфоцитами сопровождается освобождением биологически активных веществ, включая серотонин, O2- и интерферон. Интерферон, действуя на мембрану альвеолярных клеток, может стимулировать обмен фосфолипидов, арахидоновой кислоты и синтез простагландинов. Простагландины наряду с O2-, продуцируемым лейкоцитами, активируют индолеаминдиоксигеназу, катализирующую образование биогенных аминов, вовлекающихся в защитные реакции при воспалении.

Другим метаболическим звеном, где оксигеназы играют существенную роль, является обмен ненасыщенных жирных кислот и образование простагландинов. Как было отмечено выше, циклооксигеназа способна из арахидоновой кислоты продуцировать гидроперекиси липидов в результате диоксигеназных реакций. Перекисные продукты деятельности этого фермента могут оказывать активирующее воздействие на циклооксигеназу, т. е. играть роль факторов с положительной обратной связью в кинетике ферментативных реакций, способствующих образованию простагландинов. Таким образом, изменение в определенных пределах уровня гидроперекисей липидов в клетке может регулировать скорость образования простагландинов и модулировать эффективность некоторых фенольных анальгетиков и антивоспалительных агентов, действующих через простагландины. Одним из таких простагландинов, синтез которого во многом зависит от оксигеназных реакций, является проста-гландин Д,. представляющий собой мощный нейромодулятор благодаря своей способности деполяризовать мембраны нервных клеток и стимулировать в них аденилатциклазную систему.
Биологическое действие свободных радикалов кислорода

И, наконец, продукты оксигеназных реакций, протекающих с участием оксигенных радикалов, могут принимать непосредственное участие в нейрогуморальных регуляторных процессах. Оказалось, что снижение стационарной концентрации O2 в тканях может вести к уменьшению концентрации дофамина, поскольку это тормозит O2 — зависимый этап биосинтеза дофамина, т. е. образование ДОФА из тирозина с помощью фермента тирозин-3-монооксигеназы. Предполагается также участие O2 в синтезе норадреналина на стадии, катализируемой оксигеназным по своему типу действия ферментом — дофамин-β-гидроксилазой. Ловушки O2 разобщают транспорт электронов от гидроксилирования и снижают тем самым синтез норадреналина.

Супероксид в определенных физиологических концентрациях необходим для синтеза коллагена в легких.

И, наконец, пожалуй, наиболее яркой иллюстрацией «полезности» для организма активированных форм кислорода является их ключевая роль в формировании защитных реакций при воспалении — фагоцитоза, лейкоцитарной инфильтрации, очищения зоны повреждения. Как это убедительно продемонстрировано исследованиями последних лет, специфическая функция фагоцитирующих клеток осуществляется именно с помощью оксигенных радикалов. В этих клетках функционируют метаболические системы, обеспечивающие целенаправленную продукцию свободных радикалов кислорода, разрушительные свойства которых используются фагоцитами. В полиморфно-ядерных лейкоцитах продукция O2 катализируется мембраносвязанной НАДФ*H — флавопротеидоксидазой. Супероксид в мембранах клеток может генерироваться на циклооксигеназном пути обмена арахидоновой кислоты во время превращения простагландина G2 в простагландин H2. Интересно, что во время фагоцитоза pH в пределах фа-госом падает до 4,5-5,5, что является оптимальным для продукции более токсичного для клеток гидроксильного радикала (Baker, Gebicki, 1984). Поэтому для разрушения чужеродных клеток фагоциты, по-видимому, используют не только O2, но и ОН-. Нарушение O2-генерирующей функции фагоцитов лежит в основе патогенеза ряда заболеваний, для которых характерно понижение сопротивляемости к инфекциям. Так, существует форма хронического грануломатоза, биохимическая сущность которой сводится к врожденной неспособности нейтрофилов производить O2. Такие клетки могут только поглощать, но не разрушать бактерии, поэтому больные с подобным дефектом чувствительны ко многим инфекциям.

Супероксидный анион-радикал, освобождаемый во внеклеточное пространство активированными при воспалении лейкоцитами, участвует и в других важнейших реакциях. Взаимодействуя с компонентами плазмы (в том числе, возможно, с хелаторами металлов), он вызывает образование хемотаксических продуктов, усиливающих клеточную инфильтрацию при воспалении. Этими продуктами, в частности, могут быть липидные гидроперекиси. Образовавшиеся хемотаксические субстанции диффундируют к поверхности эндотелия и активируют рецепторы преимущественно в эндотелиальных клетках посткапилляров, что вызывает прилипание лейкоцитов к эндотелию и их последующую миграцию. Кроме того, накапливающиеся при воспалении в тканях свободные радикалы кислорода и гидроперекиси липидов способствуют расщеплению альтерированных молекул, субцеллюлярных структур и клеток, что облегчает очищение зоны повреждения от детрита. Следовательно, и сами активированные формы кислорода, и перекиси играют роль своеобразных неспецифических молекулярных «санитаров» (фагов), аналогичных фагоцитам, очищающим зону повреждения.

Суммируя современные представления о биологическом действии свободных радикалов кислорода, следует отметить, что отклонение их от физиологического уровня в ту или иную сторону имеет неблагоприятные последствия для жизнедеятельности клеток. Повышение стационарной концентрации оксигенных радикалов в тканях приводит к окислительной деструкции клеток, а снижение — к нарушению важнейших для клетки метаболических процессов. Поэтому регуляция уровня активированных форм кислорода и продуктов их метаболизма, иначе говоря, регуляция свободнорадикального гомеостаза имеет фундаментальное значение для обеспечения нормального функционирования клеток.